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无植物到场的高活络度皮肤致敏测试法“ADRA”

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  本文摘自和光纯药时报Vol.87 No.1(2019年1月号),由FUJIFILM股份有限公司环境与品德办理部宁静性评价中间山本裕介传授、藤田正晴传授、笠原利彦传授和勝岡尉浩传授配合执笔。


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◆媒介


  从植物福利的概念动身,植物尝试的划定正在天下规模内不时鞭策。从1993年起头,欧盟起头分阶段实施化装品成份的植物尝试划定,2013年以后,欧盟列国周全禁销含有停止过植物尝试的质料的化装品[1]

  在如许的背景下,不操纵植物的宁静性测试(植物尝试替代法)的开辟燃眉之急,皮肤安慰性、眼睛安慰性、皮肤侵蚀性、皮肤致敏性、光毒性等的植物尝试替代法作为获国际承认的体例,被参加经济协作与成长构造(OECD)的测试指南(TG)中。2006年,日本订正并实施植物保护办理法[2],尔后,3R准绳在尝试植物中取得了增强。

  对此,日本也主动鞭策植物尝试替代法的开辟,替代眼睛安慰性测试的体外短时裸露尝试[3](STE,Short Time Exposure in vitro test method)(OECD TG491)、替代皮肤致敏测试的细胞系活化尝试[4](h-CLAT,human Cell Line Activation Test)(OECD TG442E ; ANNEX I)和IL-8 Luc尝试[5](IL-8 Luc assay,Interleukin-8 Reporter Gene Assay)(OECD TG442D ; Appendix IA)都被参加了测试指南中。

  别的,日本还起头研发替代法须要用到的材料,操纵3D培育皮肤模子的用于替代皮肤安慰性测试的重组人表皮试

[6](Reconstructed Human Epidermis Test Method,OECD TG439)和操纵3D培育角膜模子的用于替代眼睛安慰性测试的重组近似人角膜表皮尝试[7](RhCE,Reconstructed Human Cornea-like Epithelium Test Method)(OECD TG492),都接纳了Japan Tissue Engineering Co., Ltd.出产的皮肤和角膜模子。

  除上述化装操行业外,欧盟的《化学品的注册、评价、受权及限定律例》——REACH律例在2016年6月也订正了REACH附录Ⅶ和Ⅷ,划定每一年出产和入口不跨越10吨的物资必须操纵植物尝试替代法来作为皮肤侵蚀性、皮肤安慰性、眼睛安慰性和皮肤致敏测试的规范测试法。

  本文将为大师先容新开辟的试替代皮肤致敏测试的氨基酸衍生物反映法(ADRA,Amino acid Derivative Reactivity Assay)。

 


◆皮肤致敏的机制与替代法


  皮肤致敏是一种由皮肤裸露在化学物资下引发的过敏反映。皮肤致敏性会使体内的免疫体系将化学物资影象为异物,是以,当皮肤再次裸露在化学物资时就会表现出过分的反映,引发红斑(发红)、水肿(肿胀)和水疱(水泡)等病症。别的,皮肤致敏性与皮肤安慰性的反映差别,免疫体系的过分反映会致使更严峻的病症。别的,因为反映触及到免疫体系,以是从皮肤裸露在致敏物资中到病症的呈现是一个庞杂的进程。OECD界说了该进程中的四个关头事务:1.卵白与致敏物资的连系,2.角质细胞的活化,3.树突状细胞的活化,4.T细胞的增殖[8]

  今朝,操纵较为普遍的in vivo(体内)皮肤致敏测试法便是用小鼠停止的部分淋逢迎尝试(LLNA,Local Lymph Node Assay),是以关头事务4为根本的评价法。而植物尝试替代法收录了6种以除关头事务4外的其余三个关头事务为根本的测试法,包含以关头事务1为根本的间接肽反映尝试[9](DPRA,Direct Peptide Reactivity Assay)(OECD TG442C),以关头事务2为根本的ARE-Nrf2荧光素酶尝试[10](ARE-Nrf2 luciferase test method,KeratinoSens™)(OECD TG442D ; Appendix IA)和ARE-Nrf2 Luciferase LuSens[11](OECD TG442D;Appendix IB),另有以关头事务3为根本的h-CLAT[4], U937皮肤致敏尝试[12](U-SENS,U937 Skin Sensitization Test)(OECD TG442E;ANNEXⅡ)和 IL-8 Luc尝试[13]

  致敏物资进入人体后和卵白连系,构成复合物,被免疫细胞当中的树突状细胞接收后,该复合物被视为抗原(异物)。这类卵白与致敏物资连系构成复合物的进程便是关头事务1,和2015年被收录于TG的DPRA不异,笔者团队开辟的ADRA也是一种操纵进程来评价反映性的测试法。

 


◆ADRA和DPRA的道理比拟


  卵白与致敏物资的连系,首要是经由进程卵白中的巯基,和半胱氨酸或赖氨酸的氨基的共价连系来完成的[13,14]。是以,DPRA操纵含有半胱氨酸的肽和含有赖氨酸的肽,经由进程这两种肽与待测物资的反映性来评价致敏物资与卵白的连系机能[15]


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图1. NAC和NAL的布局式

 

  比拟之下,ADRA利用了在半胱氨酸和赖氨酸两种氨基酸中引入了带萘环的新型氨基酸衍生物,N-(2-(1-Naphthyl)acetyl)-L-cysteine(NAC)和α-N-(2-(1-Naphthyl)acetyl)-L-lysine(NAL)(图1),经由进程测试它们与待测待测物资的反映成果来评价致敏物资与卵白的连系机能[14,15,16]

  测试步骤以下。起首,在96孔板上配制NAC、NAL和待测物资以1:50的摩尔比夹杂的反映溶液,在25℃中遮光孵育24小时。24小时后插手三氟乙酸(TFA)水溶液停止反映,而后用HPLC检测待测物资和未反映的NAC、NAL的量,从而算出待测物资的NAC、NAL的反映性(图2)。DPRA和ADRA一样,在肽与测试物资反映24小时后,用HPLC定量未反映的肽,以计较待测物资的反映性。


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图2. ADRA测试法的流程

 

  与操纵培育细胞或生物来历成份的体外(in vitro)测试差别,ADRA 和 DPRA只评价物资的化学反映(in chemico测试),是一种反复性好、切确度高的简略单纯测试法。

  虽然根基道理和测试法式不异,但ADRA用NAC和NAL来替代了肽,以是ADRA在良多方面都优于DPRA。

 

表1. ADRA与DPRA的比拟表


ADRA

DPRA

试剂

亲核试剂

品种

NAC

NAL

含有半胱氨酸的肽

含有赖氨酸的肽

在反映溶液中的浓度

5 µM

500 µM

抗氧化剂

0.2 µM EDTA

无需增加

无需增加

待测物资溶液

溶剂的品种

①水,②乙腈,③丙酮,④DMSO/乙腈

①乙腈,②水,③乙腈/水,④异丙醇,⑤丙酮,⑥丙酮/乙腈,⑦乙腈/ DMSO

在反映溶液中的浓度

0.25 mM

5 mM

25 mM

缓冲液

品种

磷酸缓冲液

磷酸缓冲液

醋酸铵缓冲液

pH

8.0

10.2

7.5

10.2

反映

反映容器

96孔板

HPLC用瓶

亲核试剂所需量

约0.3 µg/孔

约400 µg/瓶

待测物资所需量

(份子量按200计较)

0.01 mg/孔

0.2 mg/瓶

1 mg/瓶

反映液总量

200 µL

1000 µL

温度

25 ℃

时候

24小时

停止反映

停止液

溶液

TFA溶液

增加量

50 µL

HPLC检测

检测波长

281 nm

220 nm

阐发时候

20分钟/试剂

20分钟/试剂

EDTA:乙二胺四乙酸

TFA溶液:2.5%(v/v)三氟乙酸水溶液

 

  在DPRA中,反映溶液中待测物资的浓度高达5~20 mM,待测物资常常会呈现积淀的景象,并且须要在220 nm短波长下定量这两种肽,是以会呈现与待测物资来历的峰堆叠的环境(共出峰),从而没法切确地评价致敏性。

  别的一方面,因为NAC和NAL具都有萘环,以是它们能够在281 nm处定量,比DPRA长约60 nm。以是几近不与待测物资来历的峰共出峰。别的,NAC和NAL在HPLC中的检测活络度高,反映溶液中待测物资能够在0.2 mM的浓度(浓度为DPRA的1/100)下停止测试,根基上不会析出待测物资。

  除此之外,DPRA中含半胱氨酸的肽的氧化和二聚化会下降定量的切确度,但作者发明,金属离子会到场巯基的氧化,以是在ADRA中向NAC的反映溶液插手极微量的EDTA,能改良NAC的不变性[17]

  DPRA中含半胱氨酸肽的二聚体在反映溶液中的析出能够会影响HPLC的检测,并且不能对它的二聚化停止定量。而在ADRA中,能够经由进程HPLC定量而不会析出NAC二聚体,即便NAC产生氧化,也能轻易判定出对测试体系的影响。

  除上述要点之外,ADRA还能在HPLC的检测进程中增加停止液来按捺反映的停止,取得比DPRA偏差更少且更不变的数据,与在HPLC瓶中配制反映溶液的DPRA差别,ADRA操纵96孔板和多通道移液器,可完成高通量,是一种通用性好、操纵性优胜的高切确度测试法。

 


◆ADRA的致敏评价才能


  植物尝试替代法须要停止与植物尝试不异的宁静性评价。为了确认ADRA和植物尝试一样能对化学物资停止皮肤致敏评价,作者用成立DPRA测试法时操纵过的82种物资对LLNA停止瞻望切确度评价。成果显现ADRA的瞻望切确度高达87%[18]

  综上,ADRA是一种很是有用的测试法,自2016年以来,作者一向努力于将ADRA收录在OECD测试指南中。2017年,四所研讨机构到场了评价ADRA反复性与有用性的考证尝试,而该尝试在不异仪器与差别仪器间也取得了很是高的可反复性。今朝,作者正按照此成果请求将ADRA收录于测试指南中。

 


◆此后的瞻望


  如本文所述,ADRA在良多方面都优于DPRA,与其余体外替代法比拟,无需操纵培育细胞的ADRA还具备浩繁长处,如无需操纵特别举措措施、装备及无菌操纵等手艺,测试周期短、价钱低、反复性杰出等。

  欧盟制止化装品质料停止植物尝试后,化装操行业对植物尝试替代法的需要不时进步;别的,在REACH律例订正后,植物尝试替代法也被归入到除化装品质料外的普通化学品的宁静性评价中。此后,ADRA无望在化装操行业之外等更普遍的范畴中取得进一步操纵。

 


◆关头词


3R准绳

指"WordStrment:替代为不操纵植物的体例"、""Reduction:削减植物数目的操纵"和"Refinement:加重尝试对植物带来的疾苦"的3点植物尝试准绳。

 


◆参考文献


[1]

EU化粧品指令 (第7次更正) European Commission : "DIRECTIVE 2003/15/EC OF THE EUROPEAN

PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 27 February 2003,amending Council Directive 76/768/EEC on the approximation of the laws of the Member States relating to cosmetic products", Official J. 

European Union, L66/26 (2003).


[2]

環境省通告,「動物の愛護及び办理に関する施策を総合的に推進するための根基的な指針」,平成 25 年 8 月30日,第 80 号 (2013).


[3]

OECD : "Short Time Exposure In Vitro Test Method for Identifying I) Chemicals Inducing Serious

Eye Damage and II)Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye 

Damage", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 491 (2018).


[4]

OECD : "ANNEX Ⅰ : In Vitro Skin Sensitisation : Human Cell Line Activation Test (h-CLAT)", OEC

Guideline for the Testing of Chemicals 442E (2018).


[5]

OECD : "ANNEX Ⅲ : In Vitro Skin Sensitisation : IL-8 Luc assay", OECD Guideline for the Testing of

Chemicals 442E (2018).


[6]

OECD : "In Vitro Skin Irritation : Reconstructed Human Epidermis Test Method", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 439 (2013).


[7]

OECD : "Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage", OECD Guideline

for the Testing of Chemicals 492 (2018).


[8]

OECD : OECD Series on Testing and Assessment, 168, 1 (2014).


[9]

OECD : "In Chemico Skin Sensitisation: Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA)", OECD Guideline for 

the Testing of Chemicals 442C (2015).


[10]

OECD : "Appendix IA : In Vitro Skin Sensitisation : The ARE-Nrf2 Luciferase KeratinoSens™ Test

Method", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442D (2018).


[11]

OECD : "Appendix IB : In Vitro Skin Sensitisation : The ARE-Nrf2 Luciferase LuSens Test Method",

OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442D (2018).


[12]

OECD : "ANNEX Ⅱ : In Vitro Skin Sensitisation : U937 Cell Line Activation Test (U-SENS™)", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442E (2018).


[13]

Roberts D. W. et al. : Chem. Res. Toxicol., 20, 1019 (2007).


[14]

Ahlfors, S. R. et al. : Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol., 16, 59 (2003).


[15]

Gerberick, G. F. et al. :Toxicol. Sci., 97, 417 (2007).


[16]

Fujita M. et al. : J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 70, 94 (2014).


[17]

Yamamoto Y. et al. : J. Appl. Toxicol., 35, 1348 (2015).


[18]

Fujita M. et al. : J. Appl. Toxicol., in press, (2018).




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