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第四回 肽和卵白定量的新手艺

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第一三共股份有限公司 研讨开辟总部 药物静态研讨所合田 竜弥



◆媒介


由氨基酸构成的肽和卵白是基因的终究产物,间接节制着细胞的形状和功效。是以,由癌变等引发的细胞形状和功效的变更进程中,单个肽和卵白的抒发水平、翻译后润色等方针也会发生变更。这些变更能够或许作为生物标记物用于对患者停止分层,对疾病停止初期诊断,和对药效停止评价,从而对病理停止研讨。这些研讨中,须要对肽和卵白在个别内和个别间的差别停止测定,是以能检测出尽能够或许小的差别的定量体例很是首要。

别的,肽和卵白也被用作旧式药物。此中的代表案例便是抗体药物。今朝的药物开辟研讨中,研讨标的目的逐步从以小份子化合物为中间的制药转变为以抗体药物为代表的生物制药,并且抗体药物的发卖额已居天下前线。别的,包罗小份子肽在内的一些中份子药物,因为其能够或许与一些不能与小份子药物和抗体药物连系的新型靶点连系,是以对其的研讨也在主动地展开中,它作为下一代的药物被赐与高希冀。一样地,也须要有一种能够或许切确地定量肽和卵白的定量体例,来对其停止阐发。

可是,具备多个氨基酸的肽和卵白质能够或许会构成各类高等布局,与小份子化合物氨基酸的物性有很大的差别。特别是能够或许会呈现吸拥护凝固等景象,以是在阐发处置上要很是注重。这些性子在液相色谱阐发(LC)中会形成峰形差,柱添补剂的收受接管率低,难以高活络定量等题目,是以,为了定量肽和卵白,须要采用与小份子化合物氨基酸阐发完整差别的研讨体例。

对肽和卵白定量的新手艺,经由进程转变其前处置法,操纵的容器和色谱柱等前提,已设想出了各类体例以用于阐发中。本文将向大师先容一种新的定量手艺——肽吸附节制的LC阐发(Peptide Adsorption-Controlled LC, PAC-LC)。

 


◆LC阐发中肽的吸附影响


如上所述,肽和卵白的吸附使得切肯定量很坚苦,是以难以停止高活络度的定量。

比方,操纵40个氨基酸残基,份子量为4,696的肽——尿皮素,乙腈含量差别的100 μL 尿皮素溶液(1 nM)导入LC时获得的SRM(挑选反映监测形式)色谱图为图1A,保留在柱上的尿皮素峰面积值为图1B。如图所示,仅用水没法检测出浓缩溶液中的尿皮素峰。可是不管是增添了哪一种酸,成果都标明尿皮素因吸附于容器、枪头、针而形成损失,是以如许的操纵体例是没法检测出纳摩尔(nM)级别的待测物的。

别的一方面,经由进程增添乙腈能够或许检测出尿皮素的峰,可是保留在柱中的尿皮素的峰(下文简称为保留峰)的面积值不不变。这是因为,乙腈含量达到30%时,尿皮素对容器、枪头、针等的吸附没法完整躲避。别的,乙腈含量达到40%以上时,尿皮素对容器等的吸附固然能够或许防止,可是会呈现完整不保留尿皮素的峰的环境(下文简称为非保留峰),从而引发保留峰面积的削减。是以,为了定量尿皮素,须要完整防止吸附,可操纵能够或许检测到单峰尿皮素的含量30%的乙腈溶液。可是,尿皮素的吸附水平会随时候而发生变更;别的,因为还受其余的共存成份的影响,如在活体样品如许的基质庞杂的样品的检测,难以将乙腈的最适含量定为30%。



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图1. 乙腈含量差别的尿皮素溶液(1 nM)的SRM色谱和保留峰面积(B)



◆肽吸附才能的相变景象


上述所说的景象,在份子量为1,007~45k的各类肽和卵白中都能被察看获得,并且除乙腈外,另有甲醇,乙醇,乙酸,甲酸等溶剂能引发上述景象1)。是以,在样品溶液中增添无机溶剂含量,发生保留峰以外的非保留峰的景象是肽和卵白的遍及会发生的一种景象。

要诠释这个遍及景象,就要斟酌在特定的无机溶剂含量(临界值)下,肽和卵白对柱添补剂的吸附才能会俄然且可逆性地发生变更(相变)这个身分(图2)。

也便是说,斟酌到管内径和流速,导入到LC的100 μL 中的大局部尿皮素溶液在流入液相色谱柱的同时,其溶液组分会被色谱柱保留。这类环境下,因为溶液中的乙腈含量较高,尿皮素损失了对添补剂的吸附才能,它会间接经由进程色谱柱,作为非保留峰被洗脱出来。别的一种环境是,当尿皮素溶液流经色谱柱时,因为溶液与活动相夹杂,尿皮素溶液中的乙腈含量下降,尿皮素对柱添补剂的吸附才能刹时得以规复,是以能保留在柱中,成果,尿皮素作为保留峰被洗脱出。

按照这一现实,从图1A的色谱中揣度尿皮素能吸附在柱添补剂的乙腈含量临界值在30~40%之间。圆二色(CD)光谱阐发显现,这与引发尿皮素发生高等布局变更时的乙腈临界值不异2)。同时,这也显现出该高布局变更是可逆的,由此能够为,对尿皮素对柱添补剂的吸附才能的急巨变更有能够或许是与其高等布局的变更是有关的。

卵白和肽的吸附才能的相变景象也能经由进程反相分手法获得诠释: “最后散布并保留在柱进口四周的牢固相外表的卵白与肽,当活动相中的无机溶剂浓度达到必然值时,就起头从牢固相中脱附,一旦脱附,就间接从柱中洗脱出而不与牢固相有任何彼此感化。”可是,因为高等布局可逆性会带来的吸附才能的可逆性,以是有概念以为无机溶剂含量为临界值的洗脱液中的肽和卵白,会在四周的牢固相的外表反复地停止吸拥护脱附。


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图2. 肽的吸附才能相变现实



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图3. 2液和3液PAC-LC



◆肽吸附节制LC的开辟


上述局部所论述的是经由进程转变无机溶剂含量来转变肽的吸附才能的相变景象,能够或许更精确和更活络地定量肽,从而开辟了肽吸附节制LC(Peptide Adsorption-Controlled LC, PAC-LC)(图3)2-4)

PAC-LC与规范的LC比拟,水活动相用的泵地位差别,它是一种在柱前夹杂水活动相的体系。固然也能够或许操纵2液体系,但3液体系操纵时的长处是,在传统LC操纵3液体系时,无需改换毗连线路。

PAC-LC的特色是,经由进程在柱进口前与水活动相夹杂,能够或许强迫转变进样的肽四周的无机溶剂的含量。比方,乙腈含量50%的肽溶液在100%水活动相A和无机溶剂活动相B(3液体系时,活动相为B和C)的夹杂比为9:1的前提下进样时,达到柱时的肽四周的乙腈含量为5%。当使肽有吸附才能的乙腈临界值在20%的环境下,在溶液导入柱前溶液中的肽是不吸附才能;而进样后,溶液中的乙腈含量为5%,肽对柱添补剂的吸附才能刹时规复,从而保留在柱内。别的一方面,乙腈含量为50%的溶液中的肽也不会对容器、枪头、针等有吸附才能,象征着能够或许确保操纵进程和LC进样进程的定量精确性。

现实上,操纵PAC-LC检测乙腈含量差别的尿皮素溶液时,尿皮素凡是被检测出一个保留峰,并且当操纵乙腈含量比临界值(30~40%)大的的溶液检测时能够或许获得几近不异的峰面积值(图4)。别的,用乙腈含量为50%的溶液制备的尿皮素规范曲线样品的峰面积与浓度成必然比例;别的规范曲线在10 pM至10 nM的浓度规模中有着杰出的精确度(与现实值的偏差为±15%)2)。并且,乙腈含量为能够或许防止肽吸附的的样品停止反复检测时,有着杰出的检测精度(偏差小于10%),该精度与乙腈详细的含量有关3)。是以经由进程操纵乙腈含量在临界值以上的溶液能够或许防止样品制备时和进样时的吸附;别的,因为操纵PAC-LC能够或许检测出单峰,以是能够或许停止高精度的检测。

别的一方面,在操纵传统LC时,即便操纵的是规范溶液,非保留峰与保留峰的比的不法则变更会侵害检测精度3)。这是因为达到柱前,规范溶液和活动相夹杂不均而形成的。是以为了精确地定量,操纵能检测出单峰的,无机溶剂含量靠近临界值的溶液是有须要的。该现实也标明传统LC要同时高精度地定量临界值差别大的差别种的肽和卵白是很是坚苦的。

如上所述,PAC-LC与传统LC比拟,PAC-LC在测按时能检出的无机溶剂含量的规模更广,能以更高的检测精度来定量样品溶液;除此以外,PAC-LC还具备能够或许同时高精度地检测临界值差别的多种肽这一大长处。


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图4. 用乙腈含量差别的尿皮素溶液检测是的峰面积



◆操纵PAC-LC定量活体样本中的肽和卵白


比来几年来,经由进程将基因重组手艺操纵于免疫球卵白(IgG、IgM、IgD、IgE、IgA)而制得抗体药物。上市的一切抗体药物都有以IgG为基准的氨基酸序列。比来,研讨职员在主动地研讨操纵胰卵白酶消化法5)对植物和人血浆中的抗体药物定量的体例,可是为了将抗体药物与内源IgG和杂质成份停止辨别,须要挑选适合的肽片断。操纵PAC-LC时,因为能够或许对经由进程胰卵白酶消化获得的各类特点的肽片断同时停止精确的检测,是以能够或许轻松地抵消化前提和LC前提的停止优化,从而能够或许有用地获得抱负的肽片断。别的,在现实样品检测中,还能够或许经由进程同时检测多个肽来评价抗体药物在活体内的布局变更(生物转化)。

别的,在定量淀粉样卵白肽——阿尔茨海默病的首要病理特点之一的白叟斑的首要构成成份时,为了防止吸附,只要停止在含有酸和无机溶剂的溶液中浓缩CSF(脑脊液)如许简略的前处置,就能够或许操纵PAC-LC同时定量犬类CSF中的4种β-淀粉样卵白肽4)

是以,操纵肽和卵白的吸附才能的相变景象的PAC-LC,是定量活体样品中肽和卵白的有用东西。

 


◆结语


以往,肽和卵白的定量常常会操纵抗体与靶点特同性连系的配体连系法。可是,这类体例除抗体系体例备须要时候且不能保障制备胜利以外,还存在穿插反映性等题目,偶然候定量值的诠释也会很庞杂。比拟之下,LC/MS法具备基于m/z和保留时候的高挑选性,从能够或许精确地定量方针这一点来看,LC/MS是一种很是优异的阐发体例。现在,肽和卵白不只仅是作为生物标记物,在生物制药方面的操纵也备受存眷,是以须要各类检测手艺对其停止检测。但愿经由进程应用PAC-LC如许的新手艺,在此后的研讨中获得更多的停顿。

 


◆参考文献


1)Goda, R. et al. :Biomed. Chromatogr.,22, 81 (2008).

2)Goda, R, et al. : Biomed. Chromatogr.,21, 1005 (2007).

3)Goda, R, et al. : Biomed. Chromatogr.,22, 857 (2008).

4)Goda, R, et al. : J Chromatogr. B., 895, 137 (2012).

5)Hashii, N. et al. :Chromatography, 39, 7 (2018)

 


◆产物列表


FUJIFILM Wako供给高活络度MS用超高纯度乙腈溶剂,品德保障,经多变量阐发来确保合适阐发请求。


产物编号

产物称号

规格

包装

Acetonitrile

乙腈

QTofMS用

500 mL

016-26221

1 L


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