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皮肤致敏尝试替换法ADRA利用实例:

利用Wakopak® Core C18 ADRA色谱柱对"ADRA"中罕见化合物停止阐发

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富士胶片和光纯药 性能性材料研讨所 须藤勇纪



◆媒介


  当今,从掩护植物与植物尝试学相干的3R准绳(Reduction:削减、Refinement:加重疾苦、WordStrment:替换)动身,对于植物尝试的律例不时推动。特别是欧盟,其从1993年起起头阶段性制止化装品的植物尝试,2003年宣布2013年今后在欧盟地区内制止销售含有经植物尝试检测的质料的化装品的指令1),并于2009年正式化2)

  在此背景下,环球掀起了开辟植物尝试替换法的高潮。日本也在2005年设立日本替换体例考证中间(JaCVAM),多种日本研发的植物尝试替换法被收录到了经济协作与成长构造(OECD)的测试指南中3)

  本次上市的Wakopak® Core C18 ADRA公用色谱柱(产物编号:),由富士胶片团体开辟,合适2019年6月18日收录于OECD测试指南中的皮肤致敏尝试替换法,氨基酸衍生物法反映法(Amino acid Derivative Reactivity Assay, ADRA)4)的尝试请求。在ADRA中氨基酸衍生物N(-2(-1-Naphthyl)acetyl)-L-cysteine(NAC)和α-N(-2(-1-Naphthyl)acetyl-L-lysine(NAL)(图1)别离与待测化合物反映,经由过程检测其削减率,来判定待测化合物的致敏性。本文将会先容ADRA手艺进修中罕见的10个化合物阐发案例

  ADRA相干细则和其与现无体例间接多肽反映尝试(Direct Peptide Reactivity Assay,DPRA)的区分,请参考参考文献5-9)


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图1. NAC和NAL的布局式



◆尝试体例


  本文将利用ADRA试剂盒(产物编号:)及其研讨体例停止尝试。可是,本次尝试与本来的ADAR差别,不利用96孔板,而是利用PP制微管停止反映。表1为液相色谱前提。请注重, 13.5分钟后的均衡时候按照仪器的配制及夹杂器的容量差别会有所差别。


阐发仪器

 Agilent UHPLC 1290 infinity Ⅱ(Agilent 公司)

色谱柱

 Wakopak® Core C18 ADRA 3.0 × 150mm(D)

活动相A

 0.1%三氟乙酸-水溶液

活动相B

 0.1%三氟乙酸-乙腈溶液

NAC的梯度前提

 0 min.(A:B=70:30)→ 9.5 min.(45:55)→   10.0 min(0:100)→ 13.0  min.(0:100)→ 13.5 min.(70:30)→ 25.0 min.(70:30)

NAL的梯度前提

 0 min.(A:B=80:20)→ 9.5 min.(55:45)→   10.0 min(0:100)→ 13.0 min.(0:100)→ 13.5 min.(80:20)→ 25.0 min.(80:20)

流速

 0.3 mL/min

夹杂器容量

 35 μL

柱温

 40°C

检测波长

 UV 281 nm

进样量

 10 µL


表1.液相色谱前提



◆阐发成果


  表2为罕见化合物的评价成果,图2为色谱图示例。本次,经由过程利用Wakopak® Core C18 ADRA色谱柱,取得了在ADRA测试指南中罕见化合物的反映削减率,从而对其致敏性停止评价


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图2. 罕见化合物的色谱图

绿色:待测化合物白色:NAC或NAL蓝色:待测化合物+ NAC或NAL

 


编号

待测化合物

CAS RN®

性状

份子量

消融溶剂

ADRA致敏性评价成果

已知削减率(%)

削减率成果(%)

NAC

NAL

NAC

NAL

1

对苯醌

106-51-4

固体

108.09

阳性

90-100

40-70

100

61

2

对-钌砜氯酰胺三水合物(氯胺T)

7080-50-4

固体

281.69

阳性

90-100

90-100

100

97

3

肉桂醛

14371-10-9

液体

132.16

乙腈

阳性

40-100

≦ 20

43

1

4

棕榈酰氯

112-67-4

液体

274.84

乙腈

阳性

≦ 10

50-100

2

93

5

双咪唑烷基脲

39236-46-9

固体

388.29

阳性

10-45

≦ 10

35

1

6

合金欢醛

19317-11-4

液体

220.35

乙腈

阳性

10-40*

≦ 15

15

2

7

甘油

56-81-5

液体

92.09

阳性

≦ 7

≦ 7

0

0

8

苄醇

100-51-6

液体

108.14

乙腈

阳性

≦ 7

≦ 7

0

0

9

间苯二甲酸二甲酯

1459-93-4

固体

194.19

乙腈

阳性

≦ 7

≦ 7

0

0

10

对羟基苯甲酸丙酯

94-13-3

固体

180.2

乙腈

阳性

≦ 7

≦ 7

0

0


表2. 熟习化合物列表和评价成果



◆参考文献


1)European Commission : "DIRECTIVE 2003/15/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL 

1)of 27 February 2003, amending Council Directive 76/768/EEC on the approximation of the laws of the 

1)Member States relating to cosmetic products, Official J. European Union, L66/26(2003).

2)European Commission : "REGULATION(EC) No 1223/2009 OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE 

2)COUNCIL of 30 November 2009 oncosmetic products", Official J. European Union, L 342/59(2009).

3)宮崎博之,吉山友二:日薬理誌,151,48(2018).

4)OECD:"In Chemico Skin Sensitisation : Amino acid Derivative Reactivity Assay(ADRA)", OECD Guideline 

2)for the Testing of Chemicals 442C(2019).

5)山本裕介 他:和光純薬時報,87(1),12(2019).

6)Fujita, M. et al. :J. Pharmacol. Toxicol.Methods, 70, 94(2014).

7)Yamamoto, Y. et al. :J. Appl. Toxicol., 35, 1348(2015).

8)  Fujita, M. et al. :J. Appl. Toxicol., 39, 191(2019).

9)Fujita, M. et al. :Toxicol. in Vitro, 59, 161(2019).

 


◆相干产物


产物编号

产物称号

包装

ADRA Kit
ADRA试剂盒

1 kit

Wakopak® Core C18 ADRA Φ3.0 × 150 mm
Wakopak® C18 ADRA公用色谱柱

1 EA


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