SuperSep Phos-tag™是研讨卵白磷酸化的体例，无需特同性磷酸化抗体或同位素标记。
◆SuperSep Phos-tag™
Phos-tag™是一种预制胶，事后插手了50 μmol/L的Phostag™ Acrylamide，翻开包装便可间接操纵。预制胶中含有锌作为金属离子，在中间凝胶缓冲液中保管不变性很好，获得的带条成果也很整洁。
磷酸化卵白和非磷酸化卵白作为差别条带分手。
分手后，胶可用于考马斯亮蓝染色，免疫印迹和质谱尝试。
◆Phos-tag™ SDS-PAGE 的道理
◆在HighWire Search 上搜刮到的论文数
◆操纵
操纵p35的丙氨酸渐变体肯定Cdk5 激活p35的磷酸化位点
p35罕见的磷酸化位点是Ser8和Thr138。可是Ser8和Thr138位点常常会产生丙氨酸渐变，产生3种渐变体（Ser8渐变体：S8A，Thr138渐变体：T138A，Ser8和Thr138双渐变体：2A）。这3种渐变体、野生型p35、Cdk5和不激酶活性的Cdk5都来历于COS-7细胞。这些细胞裂解液用Phos-tag™ SDS-PAGE和Western blotting 停止检测（检测抗体：p35抗体）。
100 μM Phos-tag ™ 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝胶
可明白磷酸化位点和条带迁徙率的干系！
- 泳道1（条带L2和L4）和泳道5（条带M1）：p35在Cdk5的感化下产生了磷酸化；
- 泳道1（条带L2和L4）和泳道3（条带L2和L4）：在无激酶活性Cdk5的感化下，约莫有一半p35卵白在Thr138位点
产生磷酸化，一样在138位产生渐变的p35卵白亦是如斯。
- 泳道5 （条带M1）和泳道6（条带L3和L4）：Ser8和Thr138是首要的磷酸化位点；
- 泳道5（条带M1）、泳道7（条带L1和L2）和泳道8（条带M2）：条带M1是Ser8和Thr138都产生磷酸化的条带；
条带M2是只要Ser8磷酸化的条带；条带L1和L2是只要Thr138磷酸化的条带。
※ 条带L1和L3中的X 是不肯定哪一个位点产生磷酸化的条带；
※ 条带L4长短磷酸化的p35。
【参考文献】
Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States of Cdk5 Activator p35 by Phos-tag ™ SDS-PAGE. T.
Hosokawa, T. Saito, A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun 2010;9: 1133 - 1143.
【成果供给】
理化学研讨所 脑迷信综合研讨中间 回路功效研讨焦点 影象功效研讨团队 细川智永（Dr. T. Hosokawa）
都城大学东京 理工学研讨科 性命迷信专业 神经份子功效研讨室 久永真市（Dr. S. Hisanaga）
检测含有Dnmt1磷酸化激酶的片断
咱们能够肯定在片断中含有目标激酶！
① 接纳亲和色谱法从鼠脑提取液中纯化GST-Dnmt1（1-290）连系卵白
② 操纵0.3 M 和1 M NaCl 的DNA 纤维素柱洗脱获得目标卵白
③ GST-Dnmt1（1-290）作为体外激酶尝试的反映底物
④ Phos-tag ™ SDS-PAGE 用于Western blotting，肯定迁徙条带中每个片断的激酶活性
【参考文献】
The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 is regulated by phosphorylation with casein kinase
1delta/epsilon. Y. Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike,
and I. Kameshita, Biochem. J.,
【成果供给】
高知大学 综合研讨中间 性命、功效物资部分 尝试练习机械举措措施 杉山康宪（Dr. Y. Sugiyama）
香川大学 农学部 操纵生物迷信科 植物功效生化学研讨室 龟下勇（Dr. I. Kameshita）
二维电泳中的操纵：阐发hnRNP K磷酸化异构体
小鼠巨噬细胞J774.1 经LPS 安慰后，裂解细胞，颠末免疫积淀法分手获得hnRNP K。在二维电泳中，一维是IPG 胶，二维是Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分手hnRNP K 的异构体。操纵质谱仪，能够确认差别的点代表差别的亚型或润色卵白。
统一个等电点的地位上，差别位点产生磷酸化都能够被辨别开来
（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）
【参考文献】
Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity
electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara,
Proteomics, Nov 2010; 10(21): 3884-95.
【成果供给】
横滨市立大学 性命纳米体系迷信研讨科 生物体超份子体系迷信专业 木村弥生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）
理化学研讨所RCAI 小原收
◆备注
样品制备：
Phos-tag SDS-PAGE对卵白样品中的杂质很是敏感，特别是螯合剂，钒酸，无机盐，外表活性剂这类物资。
激烈倡议在Phos-tag SDS-PAGE之前经由过程TCA积淀或渗析法下降杂质含量。
转膜前处置：
另外一个必须的步骤是在转膜前，用EDTA去除凝胶中的金属离子（Mn2+或Zn2+）；
该步骤可进步卵白的转膜效力。
● 别离筹办10 mmol/L 含EDTA和不含EDTA 两种1x transfer buffer。
● 将凝胶浸泡在含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer，最少20分钟，暖和摇摆。改换新缓冲液，反复3次。
● 将凝胶浸泡在不含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer，10分钟，暖和摇摆。
● 转膜操纵*。
* 倡议用湿法转膜，以进步转膜效力。
◆品质节制
每批SuperSep Phos-tag™，出厂前均按照其产物规格停止测试，以保障可分手磷酸化和非磷酸化卵白，和他们的分手成都在一般参数内。
◆产物信息
| 产物编号 | 产物称号 | 规格 |
| 192-18001-EA-S | 1块 | |
| 198-17981-EA-S | 1块 |
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