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SuperSep Phos-tag™ 卵白磷酸化预制胶-【本勾当已竣事】


【本勾当已竣事】


  SuperSep Phos-tag™是研讨卵白磷酸化的体例,无需特同性磷酸化抗体或同位素标记。


SuperSep Phos-tag™


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  Phos-tag™是一种预制胶,事后插手了50 μmol/L的Phostag™ Acrylamide,翻开包装便可间接操纵。预制胶中含有锌作为金属离子,在中间凝胶缓冲液中保管不变性很好,获得的带条成果也很整洁。

  磷酸化卵白和非磷酸化卵白作为差别条带分手。

  分手后,胶可用于考马斯亮蓝染色,免疫印迹和质谱尝试。


Phos-tag™ SDS-PAGE 的道理


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在HighWire Search 上搜刮到的论文数


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操纵


操纵p35的丙氨酸渐变体肯定Cdk5 激活p35的磷酸化位点


  p35罕见的磷酸化位点是Ser8和Thr138。可是Ser8和Thr138位点常常会产生丙氨酸渐变,产生3种渐变体(Ser8渐变体:S8A,Thr138渐变体:T138A,Ser8和Thr138双渐变体:2A)。这3种渐变体、野生型p35、Cdk5和不激酶活性的Cdk5都来历于COS-7细胞。这些细胞裂解液用Phos-tag™ SDS-PAGE和Western blotting 停止检测(检测抗体:p35抗体)。


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100 μM Phos-tag ™ 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝胶

可明白磷酸化位点和条带迁徙率的干系!


- 泳道1(条带L2和L4)和泳道5(条带M1):p35在Cdk5的感化下产生了磷酸化;

- 泳道1(条带L2和L4)和泳道3(条带L2和L4):在无激酶活性Cdk5的感化下,约莫有一半p35卵白在Thr138位点

          产生磷酸化,一样在138位产生渐变的p35卵白亦是如斯。

泳道5 (条带M1)和泳道6(条带L3和L4):Ser8和Thr138是首要的磷酸化位点;

- 泳道5(条带M1)、泳道7(条带L1和L2)和泳道8(条带M2):条带M1是Ser8和Thr138都产生磷酸化的条带;

           条带M2是只要Ser8磷酸化的条带;条带L1和L2是只要Thr138磷酸化的条带。

※ 条带L1和L3中的X 是不肯定哪一个位点产生磷酸化的条带;

※ 条带L4长短磷酸化的p35。


【参考文献】

Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States of Cdk5 Activator p35 by Phos-tag ™ SDS-PAGE. T.

Hosokawa, T. Saito, A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun 2010;9: 1133 - 1143.

【成果供给】

理化学研讨所 脑迷信综合研讨中间 回路功效研讨焦点 影象功效研讨团队 细川智永(Dr. T. Hosokawa)

都城大学东京 理工学研讨科 性命迷信专业 神经份子功效研讨室 久永真市(Dr. S. Hisanaga)


检测含有Dnmt1磷酸化激酶的片断


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咱们能够肯定在片断中含有目标激酶!


① 接纳亲和色谱法从鼠脑提取液中纯化GST-Dnmt1(1-290)连系卵白

② 操纵0.3 M 和1 M NaCl 的DNA 纤维素柱洗脱获得目标卵白

③ GST-Dnmt1(1-290)作为体外激酶尝试的反映底物

④ Phos-tag ™ SDS-PAGE 用于Western blotting,肯定迁徙条带中每个片断的激酶活性


【参考文献】

The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 is regulated by phosphorylation with casein kinase

1delta/epsilon. Y. Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike,

and I. Kameshita, Biochem. J.,

【成果供给】

高知大学 综合研讨中间 性命、功效物资部分 尝试练习机械举措措施 杉山康宪(Dr. Y. Sugiyama)

香川大学 农学部 操纵生物迷信科 植物功效生化学研讨室 龟下勇(Dr. I. Kameshita)



二维电泳中的操纵:阐发hnRNP K磷酸化异构体


  小鼠巨噬细胞J774.1 经LPS 安慰后,裂解细胞,颠末免疫积淀法分手获得hnRNP K。在二维电泳中,一维是IPG 胶,二维是Phos-tag ™ SDS-PAGE,可分手hnRNP K 的异构体。操纵质谱仪,能够确认差别的点代表差别的亚型或润色卵白。


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统一个等电点的地位上,差别位点产生磷酸化都能够被辨别开来

(例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7)


【参考文献】

Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity

electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara,

Proteomics, Nov 2010; 10(21): 3884-95.

【成果供给】

横滨市立大学 性命纳米体系迷信研讨科 生物体超份子体系迷信专业 木村弥生(Dr. Y. Kimura)、平野久(Dr. H. Hirano)

理化学研讨所RCAI 小原收



备注


样品制备:

Phos-tag SDS-PAGE对卵白样品中的杂质很是敏感,特别是螯合剂,钒酸,无机盐,外表活性剂这类物资。

激烈倡议在Phos-tag SDS-PAGE之前经由过程TCA积淀或渗析法下降杂质含量。


转膜前处置:

另外一个必须的步骤是在转膜前,用EDTA去除凝胶中的金属离子(Mn2+或Zn2+);

该步骤可进步卵白的转膜效力。

● 别离筹办10 mmol/L 含EDTA和不含EDTA 两种1x transfer buffer。

● 将凝胶浸泡在含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer,最少20分钟,暖和摇摆。改换新缓冲液,反复3次。

● 将凝胶浸泡在不含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer,10分钟,暖和摇摆。

● 转膜操纵*。

* 倡议用湿法转膜,以进步转膜效力。


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品质节制


  每批SuperSep Phos-tag™,出厂前均按照其产物规格停止测试,以保障可分手磷酸化和非磷酸化卵白,和他们的分手成都在一般参数内。


◆产物信息


产物编号
产物称号
规格
192-18001-EA-S

1块
198-17981-EA-S

1块


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勾当已竣事




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